前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一種綠藻門(mén)小球藻屬的普生性單細(xì)胞綠藻，也稱為綠藻，是地球上最早的生命之一，可以稱之為“地球原住民”。蛋白核小球藻體內(nèi)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)素，包括蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸等，被譽(yù)為蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸含量最高的堿性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白質(zhì)含量可高達(dá)50%—70%，遠(yuǎn)高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白質(zhì)含量。它還含有8種必需氨基酸，對(duì)人體保持健康、增強(qiáng)體質(zhì)起到積極的作用。此外，蛋白核小球藻還富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡蘿卜素，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以幫助清除機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生的自由基，從而起到抗衰老的功效。它還富含多不飽和脂肪酸，如亞油酸和γ-亞麻酸等，具有調(diào)節(jié)血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不僅作為食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，還在醫(yī)藥、化妝品、飼料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
圖1. 蛋白核小球藻
隨著全球人口的增長(zhǎng)，對(duì)食物的需求也在增加，這加劇了在耕地減少和對(duì)傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)的倫理?yè)?dān)憂中尋找新蛋白質(zhì)來(lái)源的需求。微藻作為一種有前途的替代蛋白質(zhì)來(lái)源，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸（PUFAs）、維生素和礦物質(zhì)。然而，在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，由于光合作用依賴的蛋白質(zhì)合成減少，微藻通常表現(xiàn)出較低的蛋白質(zhì)含量（<40% 干重），限制了其作為替代蛋白質(zhì)來(lái)源的潛力。為了克服這些挑戰(zhàn)，開(kāi)發(fā)具有天然高蛋白質(zhì)含量的新型微藻菌株對(duì)于通過(guò)異養(yǎng)發(fā)酵高效大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)至關(guān)重要。
本研究利用常壓室溫等離子體技術(shù)（ARTP）對(duì)蛋白核小球藻的出發(fā)菌株進(jìn)行突變，產(chǎn)生大規(guī)模突變庫(kù)，然后基于MISS cell裝備，誘變后的菌液稀釋后上機(jī)生成液滴，將細(xì)胞（蛋白核小球藻細(xì)胞）包裹于液滴中，形成獨(dú)立的培養(yǎng)單元，細(xì)胞包裹在液滴中培養(yǎng)一段時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)OD600將帶菌液滴篩選至多孔板中，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定液滴的蛋白質(zhì)含量，與出發(fā)菌株對(duì)比，篩選出高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白核小球藻突變株。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
圖2. 蛋白核小球藻的篩選流程
1. ARTP誘變：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）離心去上清，用無(wú)菌去離子水洗滌，重復(fù)2-3次；最終用1mL 5%甘油重懸。取10μL上述菌懸液涂布與載片上，設(shè)置誘變功率120W，誘變時(shí)間為15s，開(kāi)始誘變。誘變結(jié)束將載片上的菌液洗脫至EP管內(nèi)的生理鹽水中。
2. 確定單細(xì)胞包裹所需的稀釋度：
通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用BG11培養(yǎng)基將誘變后菌株濃度稀釋至500-1000CFU/mL，原始出發(fā)菌株濃度稀釋至50-100CFU/mL，工作流程如下：
圖3. 樣本稀釋度確定工作流程
3. MISS cell分離培養(yǎng)：
本實(shí)驗(yàn)誘變后菌株和原始出發(fā)菌株共生成5000個(gè)液滴，培養(yǎng)10天后進(jìn)行OD600檢測(cè)及分選，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4. MISS cell工作流程
4. 蛋白質(zhì)含量測(cè)定-BCA法：
收集到的目標(biāo)液滴無(wú)需擴(kuò)大培養(yǎng)直接進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。用生理鹽水將液滴體積補(bǔ)足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，60℃孵育30min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定（吸收波長(zhǎng)562nm），與出發(fā)菌株對(duì)比，確定目標(biāo)液滴蛋白質(zhì)產(chǎn)量是否增加及增加量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 蛋白核小球藻液滴分選結(jié)果
圖5. 原始出發(fā)菌株培養(yǎng)10天液滴OD
圖6. 誘變后菌株培養(yǎng)10天液滴OD值
2. BCA法蛋白濃度測(cè)定
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原始出發(fā)菌株和誘變后菌株篩選的液滴蛋白濃度，其中誘變后有2個(gè)菌株蛋白濃度高于原始出發(fā)菌株，其中3-A8蛋白濃度與原始出發(fā)菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
圖7. BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖8. 原始出發(fā)菌株稀釋103倍培養(yǎng)10天篩選的液滴蛋白濃度
圖9. 誘變菌株稀釋200倍培養(yǎng)10天篩選的液滴蛋白濃度
總結(jié)
本研究利用ARTP和MISS cell裝備，將原始出發(fā)菌株誘變后進(jìn)行單細(xì)胞包裹，通過(guò)OD600分選和BCA法蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)含量，篩選出高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白核小球藻突變株，全程高通量、自動(dòng)化操作，可以直接對(duì)液滴進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，避免二次培養(yǎng)的操作，大幅提高了誘變和單克隆篩選的效率，為高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白小球藻選育提供了一種高效的篩選策略。
前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一種綠藻門(mén)小球藻屬的普生性單細(xì)胞綠藻，也稱為綠藻，是地球上最早的生命之一，可以稱之為“地球原住民”。蛋白核小球藻體內(nèi)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)素，包括蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸等，被譽(yù)為蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸含量最高的堿性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白質(zhì)含量可高達(dá)50%—70%，遠(yuǎn)高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白質(zhì)含量。它還含有8種必需氨基酸，對(duì)人體保持健康、增強(qiáng)體質(zhì)起到積極的作用。此外，蛋白核小球藻還富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡蘿卜素，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以幫助清除機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生的自由基，從而起到抗衰老的功效。它還富含多不飽和脂肪酸，如亞油酸和γ-亞麻酸等，具有調(diào)節(jié)血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不僅作為食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，還在醫(yī)藥、化妝品、飼料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
圖1. 蛋白核小球藻
隨著全球人口的增長(zhǎng)，對(duì)食物的需求也在增加，這加劇了在耕地減少和對(duì)傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)的倫理?yè)?dān)憂中尋找新蛋白質(zhì)來(lái)源的需求。微藻作為一種有前途的替代蛋白質(zhì)來(lái)源，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸（PUFAs）、維生素和礦物質(zhì)。然而，在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，由于光合作用依賴的蛋白質(zhì)合成減少，微藻通常表現(xiàn)出較低的蛋白質(zhì)含量（<40% 干重），限制了其作為替代蛋白質(zhì)來(lái)源的潛力。為了克服這些挑戰(zhàn)，開(kāi)發(fā)具有天然高蛋白質(zhì)含量的新型微藻菌株對(duì)于通過(guò)異養(yǎng)發(fā)酵高效大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)至關(guān)重要。
本研究利用常壓室溫等離子體技術(shù)（ARTP）對(duì)蛋白核小球藻的出發(fā)菌株進(jìn)行突變，產(chǎn)生大規(guī)模突變庫(kù)，然后基于MISS cell裝備，誘變后的菌液稀釋后上機(jī)生成液滴，將細(xì)胞（蛋白核小球藻細(xì)胞）包裹于液滴中，形成獨(dú)立的培養(yǎng)單元，細(xì)胞包裹在液滴中培養(yǎng)一段時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)OD600將帶菌液滴篩選至多孔板中，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定液滴的蛋白質(zhì)含量，與出發(fā)菌株對(duì)比，篩選出高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白核小球藻突變株。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
圖2. 蛋白核小球藻的篩選流程
1. ARTP誘變：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）離心去上清，用無(wú)菌去離子水洗滌，重復(fù)2-3次；最終用1mL 5%甘油重懸。取10μL上述菌懸液涂布與載片上，設(shè)置誘變功率120W，誘變時(shí)間為15s，開(kāi)始誘變。誘變結(jié)束將載片上的菌液洗脫至EP管內(nèi)的生理鹽水中。
2. 確定單細(xì)胞包裹所需的稀釋度：
通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用BG11培養(yǎng)基將誘變后菌株濃度稀釋至500-1000CFU/mL，原始出發(fā)菌株濃度稀釋至50-100CFU/mL，工作流程如下：
圖3. 樣本稀釋度確定工作流程
3. MISS cell分離培養(yǎng)：
本實(shí)驗(yàn)誘變后菌株和原始出發(fā)菌株共生成5000個(gè)液滴，培養(yǎng)10天后進(jìn)行OD600檢測(cè)及分選，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4. MISS cell工作流程
4. 蛋白質(zhì)含量測(cè)定-BCA法：
收集到的目標(biāo)液滴無(wú)需擴(kuò)大培養(yǎng)直接進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。用生理鹽水將液滴體積補(bǔ)足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，60℃孵育30min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定（吸收波長(zhǎng)562nm），與出發(fā)菌株對(duì)比，確定目標(biāo)液滴蛋白質(zhì)產(chǎn)量是否增加及增加量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 蛋白核小球藻液滴分選結(jié)果
圖5. 原始出發(fā)菌株培養(yǎng)10天液滴OD
圖6. 誘變后菌株培養(yǎng)10天液滴OD值
2. BCA法蛋白濃度測(cè)定
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原始出發(fā)菌株和誘變后菌株篩選的液滴蛋白濃度，其中誘變后有2個(gè)菌株蛋白濃度高于原始出發(fā)菌株，其中3-A8蛋白濃度與原始出發(fā)菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
圖7. BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖8. 原始出發(fā)菌株稀釋103倍培養(yǎng)10天篩選的液滴蛋白濃度
圖9. 誘變菌株稀釋200倍培養(yǎng)10天篩選的液滴蛋白濃度
總結(jié)
本研究利用ARTP和MISS cell裝備，將原始出發(fā)菌株誘變后進(jìn)行單細(xì)胞包裹，通過(guò)OD600分選和BCA法蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)含量，篩選出高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白核小球藻突變株，全程高通量、自動(dòng)化操作，可以直接對(duì)液滴進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，避免二次培養(yǎng)的操作，大幅提高了誘變和單克隆篩選的效率，為高產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白小球藻選育提供了一種高效的篩選策略。
