近日，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、食品科學(xué)與資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾茂茂教授團(tuán)隊(duì)課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發(fā)表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達(dá)300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報(bào)道的食品級(jí)安全菌株中最高水平。這項(xiàng)研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強(qiáng)效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預(yù)防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫(yī)藥需求增長(zhǎng)，NK全球市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，但野生菌株產(chǎn)量低（通常<200 FU/mL）限制了工業(yè)化應(yīng)用。
優(yōu)良菌株篩選方面，傳統(tǒng)技術(shù)存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產(chǎn)量閾值。
②基因工程：過表達(dá)aprN基因可提升產(chǎn)量，但存在質(zhì)粒丟失、代謝負(fù)擔(dān)及法規(guī)限制（食品級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)）。
③傳統(tǒng)誘變（紫外線、化學(xué)誘變）：突變率低，篩選周期長(zhǎng)，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
①通過氦氣等離子體產(chǎn)生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導(dǎo)隨機(jī)突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉(zhuǎn)基因，符合食品級(jí)安全要求；
③處理時(shí)間短（秒級(jí)），可通過調(diào)整功率和時(shí)間精準(zhǔn)控制突變強(qiáng)度。
④廣譜適用，目前已成功用于細(xì)菌、真菌、酵母等多種微生物的高產(chǎn)菌株選育。
二、方法與技術(shù)平臺(tái)
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產(chǎn)NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養(yǎng)物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達(dá)到OD600值為0.6-0.8。將細(xì)胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進(jìn)行誘變。SD2進(jìn)行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測(cè)定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強(qiáng)枯草芽孢桿菌的NK生產(chǎn)能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證
●發(fā)酵特性：監(jiān)測(cè)突變株的生長(zhǎng)曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長(zhǎng)速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時(shí)的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發(fā)酵36 h后，JNC002.001的NK產(chǎn)量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現(xiàn)出孢子形成受損。這對(duì)于NK生產(chǎn)可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細(xì)胞資源從孢子轉(zhuǎn)移到了次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長(zhǎng)時(shí)間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發(fā)酵過程比較。（A）生長(zhǎng)曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩(wěn)定性：連續(xù)傳代30次后，NK活性保持穩(wěn)定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學(xué)分析
SD2的基因組由一條長(zhǎng)度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列（CDS），87個(gè)tRNA基因和30個(gè)rRNA基因。
●基因組重測(cè)序：識(shí)別突變株的SNP和插入突變，定位關(guān)鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對(duì)。在 7 個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列中產(chǎn)生8個(gè)SNP：包括5錯(cuò)義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個(gè)同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區(qū)：2個(gè)SNP和1 個(gè)插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動(dòng)子中。
●轉(zhuǎn)錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達(dá)差異，重點(diǎn)關(guān)注NK合成、分泌及代謝通路。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個(gè)DEGs，其中1419個(gè)基因顯著下調(diào)，1176個(gè)基因顯著上調(diào)。
與中心碳代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控圖譜及相關(guān)通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達(dá)的比較。隨著基因表達(dá)從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
轉(zhuǎn)錄分析中與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的aprN調(diào)控因子圖譜和相關(guān)途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達(dá)的比較。隨著基因表達(dá)從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
三、主要結(jié)論
1.高產(chǎn)NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩(wěn)定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發(fā)酵周期延長(zhǎng)至72小時(shí)，NK產(chǎn)量持續(xù)積累。
2.分子機(jī)制解析
●基因組突變：發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNP和1個(gè)插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導(dǎo)致孢子形成抑制，資源轉(zhuǎn)向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變?cè)鰪?qiáng)α-酮戊二酸代謝，促進(jìn)谷氨酸積累（NK合成關(guān)鍵前體）。
●轉(zhuǎn)錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達(dá)上調(diào)9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調(diào)，能量和氨基酸前體供應(yīng)增強(qiáng)。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關(guān)基因上調(diào)，提升NK分泌效率。
四、研究亮點(diǎn)總結(jié)
1.技術(shù)方法創(chuàng)新
首次通過ARTP誘變獲得食品級(jí)安全的高產(chǎn)NK菌株，突破傳統(tǒng)誘變效率瓶頸。
結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)性揭示NK高產(chǎn)的多層次調(diào)控機(jī)制。
2.工業(yè)應(yīng)用價(jià)值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
孢子形成缺陷減少發(fā)酵后期細(xì)胞自溶，簡(jiǎn)化下游純化工藝。
關(guān)于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術(shù),開發(fā)的世界上首臺(tái)利用等離子體的手段對(duì)微生物、動(dòng)植物進(jìn)行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結(jié)構(gòu)緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數(shù)分鐘以內(nèi))即可獲得大容量突變庫(kù),極大地提高了菌種突變的強(qiáng)度和突變庫(kù)容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強(qiáng)度更高,并針對(duì)不同誘變對(duì)象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點(diǎn),進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,使操作更簡(jiǎn)便,應(yīng)用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。
致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
近日，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、食品科學(xué)與資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾茂茂教授團(tuán)隊(duì)課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發(fā)表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達(dá)300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報(bào)道的食品級(jí)安全菌株中最高水平。這項(xiàng)研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強(qiáng)效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預(yù)防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫(yī)藥需求增長(zhǎng)，NK全球市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，但野生菌株產(chǎn)量低（通常<200 FU/mL）限制了工業(yè)化應(yīng)用。
優(yōu)良菌株篩選方面，傳統(tǒng)技術(shù)存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產(chǎn)量閾值。
②基因工程：過表達(dá)aprN基因可提升產(chǎn)量，但存在質(zhì)粒丟失、代謝負(fù)擔(dān)及法規(guī)限制（食品級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)）。
③傳統(tǒng)誘變（紫外線、化學(xué)誘變）：突變率低，篩選周期長(zhǎng)，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
①通過氦氣等離子體產(chǎn)生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導(dǎo)隨機(jī)突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉(zhuǎn)基因，符合食品級(jí)安全要求；
③處理時(shí)間短（秒級(jí)），可通過調(diào)整功率和時(shí)間精準(zhǔn)控制突變強(qiáng)度。
④廣譜適用，目前已成功用于細(xì)菌、真菌、酵母等多種微生物的高產(chǎn)菌株選育。
二、方法與技術(shù)平臺(tái)
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產(chǎn)NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養(yǎng)物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達(dá)到OD600值為0.6-0.8。將細(xì)胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進(jìn)行誘變。SD2進(jìn)行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測(cè)定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強(qiáng)枯草芽孢桿菌的NK生產(chǎn)能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證
●發(fā)酵特性：監(jiān)測(cè)突變株的生長(zhǎng)曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長(zhǎng)速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時(shí)的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發(fā)酵36 h后，JNC002.001的NK產(chǎn)量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現(xiàn)出孢子形成受損。這對(duì)于NK生產(chǎn)可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細(xì)胞資源從孢子轉(zhuǎn)移到了次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長(zhǎng)時(shí)間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發(fā)酵過程比較。（A）生長(zhǎng)曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩(wěn)定性：連續(xù)傳代30次后，NK活性保持穩(wěn)定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學(xué)分析
SD2的基因組由一條長(zhǎng)度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列（CDS），87個(gè)tRNA基因和30個(gè)rRNA基因。
●基因組重測(cè)序：識(shí)別突變株的SNP和插入突變，定位關(guān)鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對(duì)。在 7 個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列中產(chǎn)生8個(gè)SNP：包括5錯(cuò)義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個(gè)同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區(qū)：2個(gè)SNP和1 個(gè)插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動(dòng)子中。
●轉(zhuǎn)錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達(dá)差異，重點(diǎn)關(guān)注NK合成、分泌及代謝通路。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個(gè)DEGs，其中1419個(gè)基因顯著下調(diào)，1176個(gè)基因顯著上調(diào)。
與中心碳代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控圖譜及相關(guān)通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達(dá)的比較。隨著基因表達(dá)從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
轉(zhuǎn)錄分析中與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的aprN調(diào)控因子圖譜和相關(guān)途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達(dá)的比較。隨著基因表達(dá)從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
三、主要結(jié)論
1.高產(chǎn)NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩(wěn)定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發(fā)酵周期延長(zhǎng)至72小時(shí)，NK產(chǎn)量持續(xù)積累。
2.分子機(jī)制解析
●基因組突變：發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNP和1個(gè)插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導(dǎo)致孢子形成抑制，資源轉(zhuǎn)向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變?cè)鰪?qiáng)α-酮戊二酸代謝，促進(jìn)谷氨酸積累（NK合成關(guān)鍵前體）。
●轉(zhuǎn)錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達(dá)上調(diào)9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調(diào)，能量和氨基酸前體供應(yīng)增強(qiáng)。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關(guān)基因上調(diào)，提升NK分泌效率。
四、研究亮點(diǎn)總結(jié)
1.技術(shù)方法創(chuàng)新
首次通過ARTP誘變獲得食品級(jí)安全的高產(chǎn)NK菌株，突破傳統(tǒng)誘變效率瓶頸。
結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)性揭示NK高產(chǎn)的多層次調(diào)控機(jī)制。
2.工業(yè)應(yīng)用價(jià)值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
孢子形成缺陷減少發(fā)酵后期細(xì)胞自溶，簡(jiǎn)化下游純化工藝。
關(guān)于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術(shù),開發(fā)的世界上首臺(tái)利用等離子體的手段對(duì)微生物、動(dòng)植物進(jìn)行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結(jié)構(gòu)緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數(shù)分鐘以內(nèi))即可獲得大容量突變庫(kù),極大地提高了菌種突變的強(qiáng)度和突變庫(kù)容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強(qiáng)度更高,并針對(duì)不同誘變對(duì)象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點(diǎn),進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,使操作更簡(jiǎn)便,應(yīng)用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。
致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
